Sostituto dermico

Cos’è il sostituto dermico

I sostituti della pelle, sostituto dermico, mirano a ripetere le proprietà della pelle nativa, tuttavia poiché mancano di molte strutture anatomiche e funzioni fisiologiche, è prevedibile che l’espressione genica nella pelle bioingegnerizzata non sarà completamente analoga alla pelle umana nativa.

I sostituti dermici contenenti una matrice dermica naturale o sintetica stanno diventando sempre più ampiamente utilizzati come modelli di test in vitro. In parte, ciò è dovuto a una maggiore attenzione alla riduzione dei test sugli animali; tuttavia, sebbene la quantità di test sugli animali possa essere ridotta, con ogni probabilità non potrà mai essere completamente sostituita da modelli in vitro.
La parola chiave nella frase precedente è modelli.
Come discusso, la guarigione delle ferite è un processo complesso che coinvolge più tipi di cellule e si verifica per un lungo periodo. Un modello per sua stessa definizione è un sistema semplificato che viene utilizzato per assistere calcoli e previsioni. Sebbene i modelli stiano diventando più sofisticati e inizino a incorporare cellule immunitarie, come le cellule dendritiche, la mancanza di un sistema circolatorio limita i dati che possono essere ottenuti.
I sostituti della pelle possono essere costruiti utilizzando una varietà di matrici dermiche da impalcature sintetiche elettrofilate e gel di collagene al derma acellulare de epitelizzato.
Tuttavia, solo il derma acellulare profondo ha una membrana basale, che è un componente cruciale nella modulazione del comportamento dei cheratinociti.

Sebbene le informazioni ottenute sugli aspetti immunologici della guarigione delle ferite da sostituto dermico siano limitate, è possibile raccogliere altre informazioni.
Le informazioni riguardanti lo stato infiammatorio della pelle possono essere ottenute tramite istologia o mediante metodi più sofisticati come la trasfezione.
Inoltre, i modelli di pelle possono essere utilizzati in modo limitato per indagare l’effetto di vari farmaci su aspetti della guarigione delle ferite come le cicatrici.
In alternativa, possono essere studiate altre condizioni della pelle come i tumori della pelle, cioè il melanoma.
MacNeil et al. ha utilizzato un sostituto della pelle a cui erano state aggiunte cellule di melanoma per studiare l’effetto dell’infiammazione sulla migrazione del melanoma.

Questo gruppo ha anche utilizzato il sostituto della pelle per valutare l’efficacia di nuovi metodi di imaging, come la tomografia a coerenza ottica, per monitorare l’invasione del melanoma, la riepitelizzazione e la ferita guarigione. Altre tecniche di imaging utilizzate per monitorare le interazioni fibroblasti-cheratinociti in questi modelli includono l’istologia, la microscopia elettronica e la microscopia confocale. La colorazione dei diversi tipi di cellule con coloranti vitali consente ulteriori indagini su come le cellule interagiscono all’interno del modello.

I sostituti cutanei sono stati utilizzati anche per valutare l’efficacia dei dispositivi di rilascio cellulare. Inizialmente il derma acellulare è stato utilizzato per valutare la capacità di un vettore sintetico di rilasciare cheratinociti autologhi.
Questo test è stato successivamente utilizzato per valutare il rilascio di una combinazione di cheratinociti e melanociti e quindi infine di cellule staminali mesenchimali.

Sostituto dermico: in conclusione

I sostituti della pelle sono i più semplici costrutti di organi di ingegneria tessutale e sono stati sviluppati nel corso di molti anni per la sperimentazione di prodotti commerciali, terapie e come modelli di biologia e patologia della pelle. Si basano sulla capacità dei fibroblasti e dei cheratinociti di formare spontaneamente una struttura simile alla pelle, ma sono stati estesi dall’inclusione di altri tipi di cellule per fornire modelli dell’ampia gamma di proprietà mostrate dalla pelle intatta. La produzione di questi costrutti su scala commerciale, in particolare per scopi terapeutici, fornisce una serie di sfide e spazio per l’ingegnosità nel bilanciare la produzione su larga scala di prodotti affidabili con le esigenze aziendali di un’impresa commerciale redditizia.

Sostituto dermico: I prodotti

I sostituti della pelle sono medicazioni ingegnerizzate progettate per facilitare la chiusura della ferita svolgendo il maggior numero possibile di ruoli chiave della pelle normale. Mancano appendici dermiche, una rete microvascolare intatta, cellule immunitarie o melanociti. In termini generali, i sostituti della pelle attualmente disponibili possono essere raggruppati in quelli progettati per sostituire la componente dermica, la componente epidermica o entrambi e quelli con una matrice dermica cellulare o acellulare

INTEGRA

Integra (Integra Lifesciences Corp, Plainsboro, NJ) è un sostituto dermico acellulare, puramente biosintetico. Integra Dermal Regeneration Template è stato il primo sostituto della pelle approvato dalla FDA. È composto da collagene (bovino) di tipo I e condroitina-6-solfato su un supporto in silicone. La matrice dermica di collagene-condroitina è progettata per consentire la crescita delle cellule dal letto della ferita, mentre lo strato di silicone funziona come un’epidermide artificiale, regolando la perdita di calore e di liquidi e fornendo un certo grado di protezione antimicrobica. Dopo l’integrazione con il letto della ferita, il supporto in silicone viene rimosso e il neoderma funge da letto ricevente per un autoinnesto a spessore parziale. Integra è approvato per l’uso nelle ferite da ustione a spessore totale e parziale.

Sostituto dermico: Necessità di modelli di guarigione delle ferite

I sostituti della pelle forniscono una valida piattaforma per lo studio in vitro di patologie cutanee, compresi i tumori epidermici. C’è un’alta incidenza di malattie della pelle segnalate ogni anno, con un americano su tre che soffre di qualche forma di malattia della pelle.
Questo numero include 3,5 milioni di nuovi casi di cancro della pelle diagnosticati ogni anno (Rogers et al., 2010).

Per oltre 100 anni, la coltura cellulare in vitro ha permesso ai ricercatori di studiare i segnali fisici e biochimici che influenzano il destino e la funzione delle cellule. La coltura cellulare in vitro ha anche fornito sistemi modello per studiare la patogenesi della malattia e la guarigione delle ferite, nonché per testare la tossicità e la cancerogenicità.
La maggior parte delle colture cellulari viene eseguita in due dimensioni su substrati di vetro o plastica trattati; tuttavia, questo ambiente estremamente semplificato non riesce a ricreare le condizioni fisiologiche nei tessuti nativi.

Ciò ha portato allo sviluppo di modelli organotipici tridimensionali (3D) della pelle per indagare meglio i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella morfogenesi epidermica, nella guarigione delle ferite e nella progressione della malattia.
Questi modelli possono essere utilizzati anche per lo screening di farmaci e cosmetici.

Sebbene nessun modello ricrea completamente la complessità della pelle nativa, diversi gruppi hanno sviluppato metodi per incorporare appendici cutanee in modelli in vitro per creare un modello più fisiologicamente rilevante.
Tuttavia, c’è ancora una significativa necessità di un modello 3D in vitro della pelle nativa che ricrea completamente i segnali biochimici e biofisici complessi nel microambiente dei cheratinociti.

Le ferite cutanee normalmente guariscono mediante la formazione di tessuto cicatriziale epitelizzato piuttosto che la rigenerazione della pelle a tutto spessore. Di conseguenza, le strategie per la gestione clinica della guarigione delle ferite sono dipese storicamente dal fornire una copertura passiva al sito della ferita consentendo al contempo i meccanismi riparativi di guarigione della ferita, tra cui la riepitelizzazione, il rimodellamento del tessuto di granulazione e la formazione di tessuto cicatriziale, per e la terapia potrebbe fare poco più che facilitare questi processi. Tuttavia, i progressi nella nostra comprensione della guarigione delle ferite, della valutazione delle ferite, dell’azione concertata di diversi fattori di crescita, del ruolo della matrice extracellulare nella regolazione del processo di guarigione e della capacità dimostrata dei costrutti bioingegneristici di promuovere la guarigione delle ferite evidenziano il potenziale per intervenire terapeuticamente nella riparazione dei tessuti fornendo l’epitelio perduto, stimolando la rigenerazione dermica e ricostituendo la pelle a tutto spessore.

I sostituti dermici bioingegnerizzati possono essere classificati sia come costrutti basati sulle cellule che stimolano attivamente la guarigione delle ferite, sia come costrutti acellulari che forniscono un substrato o copertura per facilitare la guarigione della ferita. I costrutti basati su cellule includono fogli di cellule epidermiche autologhe (Epicel®, Genzyme, Cambridge, MA), substrati dermici allogenici (Dermagraft ™, Shire Regenerative Medicine, San Diego, CA) ed equivalenti della pelle umana (HSE) composti sia da derma che da epidermide componenti (Apligraf® 1, Organogenesis Inc., Canton, MA; Orcel®, Forticell Bioscience Inc., Englewood Cliffs, NJ; StrataGraft®, Stratatech, Madison, WI) e prodotti acellulari (Transcyte®, Shire Regenerative Medicine, San Diego, CA; Integra® Dermal Regeneration Template, Integra Life Sciences, Plainsboro, NJ; Biobrane®, UDL, Rockford, IL). Un altro costrutto, che comprende cheratinociti e fibroblasti coltivati ​​in collagene bovino, è il foglio cellulare vivente, GINTUIT ™ (Organogenesis Inc., Canton, MA), indicato per l’applicazione topica a un letto della ferita vascolare creato chirurgicamente nel trattamento delle condizioni mucogengivali. Sebbene non tutti questi prodotti siano ancora disponibili in commercio, hanno rappresentato i primi nel loro genere e sono il risultato della ricerca di base nella biologia della guarigione della pelle e delle ferite e dell’esperienza clinica con innesti cutanei, innesti di cheratinociti coltivati, matrici di collagene acellulare, cellule matrici e innesti compositi coltivati ​.

Entrare in clinica

Impalcature a seme cellulare

I prodotti sostitutivi della pelle coltivati, in cui le cellule vengono seminate su una matrice biodegradabile e coltivate ex vivo prima della spedizione e dell’uso, sono stati straordinariamente difficili da commercializzare. Data questa realtà, è interessante che i fornitori dei due principali equivalenti cutanei siano i veri primi pionieri dell’ingegneria dei tessuti. Sia Advanced Tissue Sciences che Organogenesis si sono impegnate in uno sforzo coraggioso per utilizzare fibroblasti e biomateriali umani per rigenerare la pelle. Sono stati sfidati da un panorama normativo in evoluzione, una lotta continua con problemi di rimborso e la necessità estremamente complessa di produrre e spedire un prodotto vivente. Un caso di studio completo di ATS o Organogenesi sarebbe di enorme valore per la prossima generazione di società di ingegneria dei tessuti, ma va oltre lo scopo di questo capitolo. Dermagraft®, il prodotto Advanced Tissue Science ora prodotto da Smith & Nephew, utilizza cellule della pelle isolate dal prepuzio neonatale prima della semina su uno scaffold polimerico. Apligraf®, il prodotto dell’organogenesi, ha utilizzato una tecnologia simile per seminare e coltivare cellule su scaffold a base di collagene. Continuano a essere sviluppati equivalenti cutanei di ingegneria tessutale. Con il miglioramento della tecnologia e il progresso dei sistemi multistrato verso un ampio uso clinico, anche il mercato dovrebbe aumentare dai livelli di anemia odierni di 15 milioni di dollari all’anno. La FDA e le questioni relative al rimborso hanno avuto un grande impatto sull’uso clinico di equivalenti cutanei coltivati. La FDA ha trattato questi prodotti come dispositivi, ma li ha tenuti a standard biologici, e questo ha portato inevitabilmente al loro rimborso come biologici.

Un altro approccio al rimodellamento clinico della pelle è l’utilizzo di terapie cellulari autologhe (Fig 3.2). Una caratteristica interessante dell’utilizzo delle cellule di un paziente è, ovviamente, la mancanza di una risposta immunitaria, ma la produzione di sostituti della pelle specifici per il paziente ma poco costosi è molto complessa. Epicel® di Genzyme Biosurgery utilizza fibroblasti di topo irradiati come strato di alimentazione da cui far crescere cheratinociti specifici del paziente. La co-coltura con cellule di derivazione animale può sollevare questioni normative e di malattie infettive che richiedono pratiche di produzione che aumentano il costo delle merci.

Ponteggi a base tessile per l’ingegneria dei tessuti

Requisiti specifici per scaffold fibrosi

Per ottenere un ripristino dei tessuti e delle funzioni degli organi di successo, uno scaffold fibroso deve soddisfare alcuni criteri fondamentali. In primo luogo, la dimensione dei pori deve essere adeguata e la porosità sufficientemente elevata per facilitare la semina cellulare e consentire uno scambio efficiente di nutrienti cellulari e rifiuti metabolici tra le cellule aderenti e il letto ospite. Le cellule che risiedono in uno scaffold fibroso sono in grado di muoversi ameboide spingendo da parte le fibre circostanti e quindi espandendo i pori all’interno dell’impalcatura. In questo modo, lo scaffold fibroso offre alle cellule l’opportunità di regolare in modo ottimale il diametro dei pori e migrare in aree in cui alcuni dei pori iniziali sono relativamente piccoli (Li et al. 2002). La relazione tra il diametro dei pori e la crescita del tessuto sarà discussa nella sezione 12.4.

Inoltre, le proprietà meccaniche di uno scaffold fibroso contribuiscono al suo successo nell’ingegneria dei tessuti perché uno scaffold non solo fornisce un substrato per la residenza cellulare, ma aiuta anche a mantenere la stabilità meccanica nel sito del difetto dell’ospite (Li et al. 2002 ). Uno scaffold di ingegneria tessutale efficace deve soddisfare almeno due requisiti meccanici. In primo luogo, deve essere sufficientemente stabile perché un medico possa maneggiare e impiantare lo scaffold nel sito target dell’ospite. In secondo luogo, dopo il trapianto, le architetture dello scaffold nel processo di biodegradazione devono fornire sufficienti supporti biomeccanici durante la rigenerazione dei tessuti (Li et al. 2002).

Le proprietà meccaniche di un ponteggio ingegnerizzato sono determinate non solo da fattori intrinseci come le composizioni chimiche del materiale, ma anche da fattori estrinseci, come la geometria della costruzione o la disposizione architettonica degli elementi costitutivi (Li et al. 2002).

Per alcune applicazioni come gli innesti vascolari che comportano stress pulsatile, ci saranno requisiti speciali in termini di compliance ed elasticità dei materiali (Wang et al. 2005). Se la compliance e la distensibilità dell’innesto non sono soddisfatte, si verificherebbero disturbi del flusso sanguigno e le lesioni endoteliali sarebbero causate dall’aumento dello stress meccanico vicino ai siti anastomotici (Doi et al. 1997). Tuttavia, l’incorporazione di fibre elastiche o polimeri negli scaffold per innesti vascolari aumenterà la compliance degli scaffold alla pressione emodinamica.

Ultimo ma non meno importante, la biodegradabilità è una considerazione importante per la selezione di un materiale per scaffold. Idealmente, uno scaffold biodegradabile viene assorbito dai tessuti circostanti e metabolizzato nel corpo dopo aver soddisfatto gli scopi previsti. Ad esempio, il poli- (dl-lattide-co-glicolide) (PLGA) è un biomateriale ampiamente utilizzato che può idrolizzarsi in monomeri di lattide e glicolide, che successivamente si scompongono in acqua e anidride carbonica attraverso il ciclo di Krebs (Bazile et al. 1992). La velocità di degradazione dovrebbe corrispondere alla velocità di formazione del tessuto. Ciò significa che le cellule residenti dovrebbero proliferare, differenziarsi e costruire ECM sufficiente per la ricostruzione dei tessuti mentre i materiali dello scaffold si degradano gradualmente nel tempo.

Cambiare la pratica medica

L’introduzione di sostituti della pelle ha richiesto la formazione dei medici che si occupano di ustioni sull’uso corretto di questi prodotti. Poiché la maggior parte dei medici è prudente quando applica nuove tecniche, occorrono molti anni prima che i nuovi prodotti siano pienamente utilizzati nella comunità chirurgica. Durante questo processo di apprendimento, il produttore di questi prodotti vedrà un graduale aumento nell’uso del prodotto. Dalla concezione originale di idee diverse per i sostituti della pelle, molto è cambiato nel trattamento delle ustioni. La rianimazione con fluidi, l’assistenza nutrizionale, i miglioramenti nella ventilazione e gli antimicrobici topici sono tutti migliorati. Molti chirurghi hanno iniziato a utilizzare il concetto di conservazione dermica come metodo per massimizzare la funzione della pelle. Di conseguenza, più ustioni cutanee medio-profonde vengono ora trattate in attesa e lasciate guarire. Ciò ha ridotto la richiesta di escissione e innesto per molti dei nostri pazienti con ustioni di grandi dimensioni. Ora abbiamo più informazioni sulla sopravvivenza di ustioni di grandi dimensioni con una migliore comprensione da parte del pubblico di ciò che è coinvolto nella cura delle ustioni per la vittima gravemente ustionata. C’è una maggiore accettazione sia tra i medici che tra le famiglie di non trattare in modo aggressivo alcune ustioni di ampia superficie corporea che hanno un’alta probabilità di mortalità. Insieme al numero decrescente di ustioni di grandi dimensioni, la combinazione dei suddetti fattori ha portato a una riduzione della domanda di sostituti della pelle per le vittime di ustioni negli Stati Uniti.

Nei capitoli seguenti, studiamo attentamente la scienza della rigenerazione della pelle, esaminiamo prodotti specifici in dettaglio e aspettiamo anche nuove idee e sfide che consentiranno agli scienziati di sviluppare la prossima generazione di tecnologie di sostituzione della pelle.

Costruzioni della pelle bioingegnerizzate

L’ingegneria dei tessuti cutanei è stata per molti anni in prima linea nell’ingegneria dei tessuti e ora ha prodotto alcuni dei primi prodotti medici derivati ​​dall’ingegneria dei tessuti. Oggi, oltre 200.000 pazienti sono stati trattati con prodotti per la pelle di ingegneria tessutale. Questo è il risultato del lavoro degli ultimi 30 anni nelle aree della biologia delle cellule della pelle, della biologia delle matrici extracellulari, degli scaffold di collagene, degli scaffold polimerici e degli equivalenti dei tessuti. La riparazione della pelle mediante l’ingegneria dei tessuti ha assunto molte forme, da semplici a complesse. Le varie strategie sono discusse in questo capitolo, con un’enfasi sulla rilevanza biologica di ciascuna per la normale struttura e funzione della pelle e per la guarigione delle ferite.

Le ferite cutanee normalmente guariscono mediante la formazione di tessuto cicatriziale epitelizzato piuttosto che la rigenerazione della pelle a tutto spessore. Di conseguenza, le strategie per la gestione clinica della guarigione delle ferite sono dipese storicamente dal fornire una copertura passiva al sito della ferita consentendo al contempo i meccanismi riparativi della guarigione della ferita: riepitelizzazione, rimodellamento del tessuto di granulazione e formazione di tessuto cicatriziale. La terapia potrebbe fare poco più che facilitare questi processi poco conosciuti. I progressi nella nostra comprensione della guarigione delle ferite, la valutazione della ferita, l’azione concertata di diversi fattori di crescita, il ruolo della matrice extracellulare nella regolazione del processo di guarigione e la capacità dimostrata dei costrutti di ingegneria tissutale di promuovere la guarigione delle ferite evidenziano il potenziale per intervenire terapeuticamente nella riparazione dei tessuti fornendo l’epitelio perduto, stimolando la rigenerazione dermica e ricostituendo la pelle a tutto spessore.

I sostituti della pelle ingegnerizzati per i tessuti sono classificati in due categorie generali; prodotti a base cellulare, che stimolano attivamente la guarigione delle ferite; e prodotti acellulari, che forniscono un substrato o copertura per facilitare la guarigione della ferita. I sostituti cellulari includono fogli di cellule epidermiche autologhe (Epicel®, Genzyme Tissue Repair, Cambridge, MA), substrati dermici allogenici (Dermagraft ™, Advanced BioHealing, La Jolla, CA) ed equivalente della pelle umana (HSE), composto da dermico vivente e componenti epidermiche (Apligraf®, 1 Organogenesis Inc., Canton, MA, Orcel®, Ortec International, New York, NY). I prodotti acellulari includono Transcyte® (Advanced BioHealing), Integra® Artificial Skin (Integra Life Sciences, Plainsboro, NJ) e Alloderm® (Life-cell Corporation, Branchburg, NJ). Questi prodotti rappresentano i primi nel loro genere e sono il risultato della ricerca di base nella biologia della guarigione della pelle e delle ferite e dell’esperienza clinica con innesti cutanei, innesti di cheratinociti coltivati, matrici di collagene acellulare, matrici cellulari e innesti compositi coltivati.